为什么脑瘤新药总在临床卡住？
他们用生物3D打印做出患者的
肿瘤活模型，养6周、传5代

胶质母细胞瘤（GBM）是成年人中最常见的原发性恶性脑肿瘤，也以侵袭性强、预后极差著称。十多年来，临床的标准方案一直是「最大范围手术切除＋替莫唑胺化疗＋放疗」，可它对中位生存期的延长依然有限。论文指出的一个关键原因是：体外模型不够「像」真肿瘤——很多在临床前有效的化合物，进了临床试验就拿不出显著生存获益。

2026 年，中国药科大学、复旦大学附属华山医院神经外科、上海益诺思等团队在 Chemical Engineering Journal 发表研究：用3D 生物打印，把手术取下的患者肿瘤细胞装进「仿细胞外基质」水凝胶里，做出了能连续培养 6 周以上、传代至少 5 代的 GBM 模型；并第一次把传代后的模型用于 CAR-T 细胞产品的评价。而模型预测力到底靠不靠得住，论文给了一个很硬的答案——它的抗原表达水平，能对应上 CAR-T 的活化强度。

01 最凶险的脑瘤，卡在了「模型」这一环

论文开篇把问题摆得很直白。中枢神经系统肿瘤种类繁多，而胶质母细胞瘤（GBM）是成年人中最常见的原发性恶性脑肿瘤，因高度侵袭性而几乎总是致死。尽管临床试验做了很多，十多年来一线方案还是那套组合拳——最大范围手术切除、替莫唑胺（TMZ）化疗、放疗——可它对中位生存期只有有限的延长。

为什么这么难？论文给出了两层原因。

于是问题就变成了：怎么造一个足够「生理相关」的临床前模型，能比较准地预测药物响应，还能为个体化方案提供依据。

论文承认，3D 生物打印这几年在精准肿瘤领域推进很快：它可以用载活细胞的生物墨水，快速在体外造出结构复杂、保留空间复杂度与细胞-基质相互作用的组织构建体。研究团队此前也建立过患者来源的 3D 生物打印 GBM 模型，对 TMZ 响应展现出更好的预测准确性。

但有一件事此前始终没被验证。论文写得很清楚：现有的患者来源 3D 打印模型确实能忠实保留亲本肿瘤的遗传特征，包括突变谱与拷贝数变异；但这些 GBM-3DP 模型能否长期培养并连续传代，「仍不明确」；而超过第 5 代之后，模型的分子保真度「仍未被验证」。体外长期培养时，不受控的肿瘤细胞增殖还常常带来遗传改变。

所以这项研究要回答的问题很聚焦：患者来源的 GBM 3D 打印模型，能不能长期养、连续传，还能不「变味」？如果答案是能，它就有资格去做另一件更难的事——用来评价个体化的细胞免疫方案。

02 先给肿瘤细胞造一个「家」：刚度要像真脑瘤

肿瘤细胞待在什么样的「基质」里，直接决定它的行为。论文强调，细胞外基质（ECM）在决定播散肿瘤细胞命运上有核心作用，所以要做出生理相关的模型，就必须复刻这个微环境。

GBM 的 ECM 很特殊。论文描述它富含透明质酸（HA）、糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白，同时显著缺乏胶原。而 HA 会通过与透明质酸介导运动受体（RHAMM）、CD44 等受体的相互作用，加上机械与拓扑线索，显著促进 GBM 的进展与侵袭。

对应到材料选择上，团队用了两种可光交联组分：

加光引发剂 LAP，就构成了一整套配方。团队的筛选变量是：GelMA 取 2%、4%、6%、8%，HAMA 取 0.25%、0.5%、1%、2%，LAP 取 0.1% 和 0.2%，逐一测压缩模量、流变行为、孔结构和化学组成。

筛选的「标尺」来自真实组织

论文列出了一组很关键的参照数据：人正常脑组织的模量约为 0.1–1 kPa，GBM 患者组织约为 7 kPa；临床测量显示 GBM 组织刚度可达 26 kPa；也有研究用 3 kPa 与 20 kPa 来模拟 GBM 的基质刚度。基于这些基准，论文把刚度低于 3 kPa 或高于 20 kPa 的配方直接排除。

结果很清晰：刚度随 GelMA 与 HAMA 浓度显著升高。以 4% GelMA 这一行为例，HAMA 从 0.25% 增到 2%，压缩模量从 2.59 ± 0.18 kPa 一路升到 43.97 ± 8.03 kPa；而 8% GelMA 配 2% HAMA 时，模量已经达到 126.46 ± 7.21 kPa。

为什么最后选的是「4% + 0.5% + 0.1%」

流变学上，所有墨水都呈现典型的黏弹性液体行为，在较长时间尺度上弹性模量 G′ 超过黏性模量 G″，说明以类固体（凝胶态）行为为主。论文解释：GelMA 浓度越高，交联位点越多、交联密度越高，机械强度上去了，但也会带来过度固化；HAMA 浓度越高，甲基丙烯酰基越多，同样光照条件下网络越致密。

SEM 观察印证了这一点：0.25% 与 0.5% HAMA 对孔径影响很小，而 1%、2% HAMA 会显著减小孔径；6%、8% GelMA 也会减小孔径。论文引用文献指出，100–200 μm 的孔径有利于类器官的长期培养与扩增。

在 3–20 kPa 这个生理相关区间里，团队用 U87 细胞系测了细胞相容性，4% GelMA、0.5% HAMA 的组合支持最高的细胞活率。至于 LAP，0.2% 相比 0.1% 会带来更高的压缩模量和更高的 G′、G″，对孔径影响不大，但 0.2% LAP 组出现了碎裂的形貌，提示相同打印参数下出现了局部过固化。

综合下来，论文把4% GelMA、0.5% HAMA、0.1% LAP定为最优配方——刚度合适、结构完整、交联均匀，足以支撑患者来源 GBM 模型的长期培养。

03 「打印」：为什么低交联密度反而是关键

材料选好了，接下来是工艺。论文采用的是3D 生物打印：用 405 nm 波长的光，按层投影固化含细胞的墨水。

团队系统优化了两个关键参数：光强和曝光时间。而实验揭示出一个略带反直觉的结论。

• 固定曝光时间（20 s）、改变光强：墨水压缩模量随光强成比例升高，反映交联密度提高；但更高的光强会让水凝胶表面逐步「凝胶化」。
• 固定光强（30%）、改变曝光时间：刚度同样随曝光时间升高，但结构会逐步破坏、断裂，提示过度曝光与过度交联。

一句话概括这一章的取舍：够硬能成型、够软能养细胞——而生物打印的工艺窗口，恰恰就卡在这两者之间那条很窄的缝里。

04 让患者的肿瘤，在培养皿里「活下去、传下去」

最核心的验证环节来了：从手术台上刚取下来的肿瘤组织，到能反复传代的模型，中间发生了什么？

论文使用的是复旦大学附属华山医院神经外科的新鲜脑肿瘤标本，伦理批件号 KY2023-846，全部患者签署知情同意。共 4 例患者，年龄 43–74 岁（1 男 3 女）。组织放在组织保存液中运回实验室，随机取小块分别用于冻存（提 DNA）、甲醛固定（病理与免疫荧光），其余部分进入建模流程。

解离用了一套「酶解组合拳」：先机械剪成 0.5–1 mm³ 的小块，再用含有 I 型胶原酶（2 mg/mL）、透明质酸酶（1 mg/ml）、DNase I（0.1 mg/ml）的溶液在 37 °C 摇床消化 30 min，随后过 70 μm 滤网、离心，再用碎片去除液和红细胞裂解液处理。论文强调，这套酶解配方是为高细胞活率优化过的。

接着就是打印。细胞重悬后与预聚液按 1:1 混合，用 405 nm 生物打印机固化成型，然后浸入培养基培养。维持培养基的配方也很有讲究——用的是 DMEM/F12 与 Neurobasal（1:1）的神经基础培养基，加上 N2、B27（不含维生素 A）、GlutaMax、NEAA，以及 EGF、FGFb 各 20 ng/ml 和 5 μg/ml 肝素——这是典型的神经干细胞/胶质瘤干细胞培养体系。

然后就是等待。论文记录了这些模型的形态差异：在明场下，不同的 GBM-3DP 表现出铺展型、实心型、囊性型、「葡萄串样」以及混合型等多种形态。培养 21 天里，球体直径逐步增大，可达约 150 μm。

关键的一步是「再打印」。当肿瘤细胞长到直径约 150 μm 时，团队把它们收集起来，重新混入新鲜墨水，再次打印——如此迭代，就得到了多代次的构建体。而论文报告的结果是：形成效率、形态和生长动力学在各代次之间保持一致。经过冻存再复苏的细胞，也依然保持了很高的生长活性。

论文给出的成功判定标准是：模型能维持生长超过 6 周，或传代 ≥ 5 代，并且经历多次冻融后仍能生长。这组数字，正是这项工作与既有 GBM 模型拉开差距的地方。

05 养出来的东西，到底像不像原来的肿瘤？

能养、能传，只是第一步。真正的问题是：它还是原来那个肿瘤吗？论文从三个层面做了「体检」——病理形态、细胞组成、以及后面的基因层面。

第一份体检：病理形态

H&E 染色显示，所有 GBM-3DP 模型都保留了高级别胶质瘤的诊断性组织病理特征。初代模型（3DP_P0）和长期传代后的模型（3DP_P5）都表现出亲本肿瘤典型的细胞与细胞核异型——核分裂象丰富、细胞核多形性明显；肿瘤细胞呈簇状分布，核大、核质比高、核轮廓不规则。

有一个细节值得记下来。论文提到，通常认为高增殖潜能（以 Ki67 指数反映）与更高的建模成功率相关，但本研究中，不同 Ki67 指数队列之间的建模成功率并没有明显差异。Ki67 染色显示，模型基本维持了对应亲本肿瘤的增殖率——亲本肿瘤、3DP_P0 与 3DP_P5 的 Ki67 阳性细胞比例相当。

此外，用 CA9 免疫染色确认的缺氧区域、用 CD31 标记确认的血管内皮细胞，都在这套模型里被保留了下来。缺氧和血管，正是 GBM 微环境最典型的两个特征。

第二份体检：细胞组成

团队用一组标志物做了谱系分析：胶质标志物 GFAP、成熟神经元标志物 MAP2、未成熟神经元标志物 DCX，以及神经祖细胞与胶质瘤干细胞标志物 NESTIN、SOX2、OLIG2。结果显示，初代模型与传代模型都保留了亲本肿瘤的细胞组成与形态。

定量结果更有意思：在多数病例中，亲本肿瘤与对应 3DP_P0 的 OLIG2+ 和 SOX2+ 细胞频率相近；而到了 3DP_P5，这两个群体反而增多——论文对此的解读是，这提示模型在持续生成亲本肿瘤的细胞多样性，而不是在培养中「变单调」。

更难得的是免疫细胞。团队分别用巨噬细胞/小胶质细胞标志物 CD11b 与 Iba1 做免疫荧光，发现培养两周以及连续传代之后，这类细胞依然被保留。要知道，很多体外模型养着养着，微环境里的免疫成分就悄悄消失了。

06 养到第 5 代，基因有没有「跑偏」？

这才是论文要正面回答的那个问题。团队对3 例患者的亲本肿瘤、配对的 3DP_P0 与 3DP_P5 做了全外显子测序（WES），重点看 GBM 相关关键基因上的体细胞变异，例如 DRD5、EGFR、PTEN、LZTR1、NF1、TTN。

结果是：亲本肿瘤中存在的绝大多数体细胞变异，在 3DP_P0 与 3DP_P5 中都能被稳定检出；亲本肿瘤的拷贝数变异（CNV）同样在对应的 3DP_P0 与 3DP_P5 中被忠实重演。

基因之外，论文还查了「表观遗传」层面，用的是 935k 甲基化位点的 EPIC 芯片。几项分析指向同一个结论：

• 主成分分析（PCA）显示，3DP_P5 样本与其配对的 3DP_P0 紧密聚类；
• 热图进一步确认，3DP_P0 与 3DP_P5 的甲基化 β 值高度一致；
• 由甲基化阵列推导的 CNV 在 3DP_P0 与 3DP_P5 间保持相似（以 5640_HS 为例）；
• t-SNE 分析显示，所有 3DP_P5 与其对应的 3DP_P0 紧密聚类，主要代表 IDH 野生型 GBM。

论文的判断是：3DP_P0 与 3DP_P5 拥有几乎一致的 DNA 甲基化组，说明这套 GBM-3DP 方案适合长期培养。

最后一道保险是身份鉴定。3DP_P5 样本（5258_HS、5324_HS）经过 20 个位点的 STR 分析，确认与原始亲本肿瘤遗传学一致（似然比分别为 2.3869 × 10³⁰ 和 1.0608 × 10²³），并且与公共细胞库无匹配。论文团队还做了物种鉴定与支原体检测，以确保培养过程的洁净与真实。

07 最硬的一关：用传了 5 代的模型去测 CAR-T

论文把这一步称为「最具变革意义」的部分。背景是这样：CAR-T 细胞产品在血液肿瘤中表现出变革性的效果，但在实体瘤上效果有限。而 GBM 复发背后的细胞异质性，正是这类方案要面对的难题。论文所用的 CAR-T 细胞产品名为 SNC109 注射液，目前正在复发 GBM 的 I 期临床试验中（注册号 CTR20243306），由上海先博生物提供；实验中的对照是 Mock-T 细胞。

论文特别强调了一个时间点：这套流程能在术后 2–3 周内完成患者特异性 GBM-3DP 模型的构建，从而支持「实时并行」的干预测试——也就是说，模型有可能在患者还需要决策的时候，就给出前瞻性的参考信息。

先确认：靶抗原还在不在

免疫组化结果显示：IL13Rα2 与 HER2 在 4 例标本中都检测不到；而 EGFR 与 EGFRvIII 在 3DP_P0 中的表达模式与亲本肿瘤定性一致，并在 3DP_P5 中得到保留。这为后续的抗原特异性评价打好了基础。

再看结果：肿瘤细胞死没死、T 细胞活没活

共培养在 24 孔板中进行，覆盖 4 例患者、每例 5–6 个重复，逐日观察。论文报告的证据链相当完整：

• Mock-T 与 CAR-T 都能浸润进 GBM-3DP 构建体，但只有 CAR-T 组出现明显的时间依赖性肿瘤细胞裂解，Calcein-AM/PI 染色进一步确认；
• cleaved-Caspase3 免疫染色信号升高，确认共培养 3 天后肿瘤细胞凋亡；同时 EGFR 与 EGFRvIII 表达下降，提示抗原特异性地靶向并清除了 EGFR+ / EGFRvIII+ 肿瘤细胞；
• 显著的 T 细胞扩增只出现在 CAR-T 处理组，且这些 CD3+ T 细胞呈 Ki67 阳性，说明在共培养过程中 CAR-T 细胞被持续激活；
• 免疫染色观察到含颗粒酶 B 的 T 细胞紧邻凋亡的 EGFR+ 与 EGFRvIII+ 肿瘤细胞；CD3 与 GBM 标志物 NESTIN 的共染则显示，CAR-T 清除了 NESTIN+ 的靶肿瘤细胞；
• 细胞因子层面，ELISA 检测的 IFN-γ、IL-2、TNF-α 均呈强而持续的释放，峰值出现在第 1 或第 2 天；而空白对照、单独 GBM-3DP 组、以及 GBM-3DP 与 Mock-T 共培养组中，细胞因子均检测不到。

论文也坦率地写下了边界：共培养 3 天后，仍有大量表达 EGFR 与 EGFRvIII 的肿瘤细胞残留。这说明 CAR-T 对其预期靶点高度特异，但在该实验条件下并没有清除全部肿瘤细胞。对一篇方法学论文来说，这种「不完美」的如实记录，恰恰是它可信的地方。

08 这个平台的边界，以及它想去的地方

论文在讨论部分主动列出了两项限制。

但论文同时强调，这些挑战并不削弱平台的稳健性，反而指出了明确的改进方向。对于未来，论文给出了一个颇具想象力的路径：把这类模型与神经血管单元芯片或多器官系统整合，从而模拟与血脑屏障的相互作用、捕捉系统性的药物响应。论文认为，「生物打印＋微生理系统＋免疫评价」的融合，有潜力改变实验性方案被开发和验证的方式。

论文的结论是：这套 GBM-3DP 平台兼具稳健性与可扩展性，并且有直接的临床相关性。

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